脱氢抗坏血酸（dehydroascorbate，DHA）含量测定试剂盒说明书

更新时间：2025-01-13

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脱氢抗坏血酸（dehydroascorbate，DHA）含量测定试剂盒说明书

分光光度法 50 管/48 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

AsA 作为植物细胞一个重要生理指标，其 AsA 的含量、氧化还原状态(AsA/DHA 比率)及其合成与代谢相关酶类活性的变化涉及植物对一系列环境胁迫的响应。DHA 是AsA 的可逆的氧化型，在生物体内，与抗坏血酸共同组成氧化还原系统，具有电子受体的作用。

DTT 还原DHA 生成AsA，通过测定体系中AsA 的生成速率，即可计算出 DHA 含量。

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 10ml 蒸馏水充分溶解。

标准品：粉剂×1 瓶， 4℃保存。临用前加入 5.743 ml 蒸馏水充分溶解；吸取 0.1 ml 上述溶液，加入 0.9 ml蒸馏水，混匀，即为 100μmol/L DHA。

低温离心机、紫外分光光度计、1ml 石英比色皿、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 试剂一）进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心 20min，取上清置冰上待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴ 个）：试剂一体积（ml）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1ml 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；12000g， 4℃离心 10min，取上清液置于冰上待测。

3. 血清等液体：直接测定。

1. 分光光度计预热 30 min，调节波长到 265 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二在 25℃水浴锅中预热 30 min。

3. 标准管：依次在 1ml 石英比色皿加入 100μl 标准液、800μl 预热的试剂二和 100μl 试剂三，迅速混匀后于 265nm 比色，记录 10s 和 130s 的吸光值A1 和A2，△A 空白管=A2-A1。

4. 测定管：依次在 1ml 石英比色皿加入 100μl 上清液、800μl 预热的试剂二和 100μl 试剂三，迅速混匀后于 265nm 比色，记录 10s 和 130s 的吸光值A3 和A4，△A 测定管=A4-A3。

注意：标准管只需测定一次。

(1). 按蛋白浓度计算

DHA(nmol/mg prot) =[C 标准液×△A 测定管÷△A 标准管×V 标准]÷（Cpr×V 样）

=100×△A 测定管÷△A 标准管÷Cpr

(2). 按样本质量计算

DHA(nmol/g 鲜重) =[C 标准液×△A 测定管÷△A 标准管×V 标准]÷(W×V 样÷V 样总)

=100×△A 测定管÷△A 标准管÷W

(3). 按细胞数量计算

DHA(nmol/10⁴ cell) =[C 标准液×△A 测定管÷△A 标准管×V 标准]÷(W×V 样÷V 样总)

=100×△A 测定管÷△A 标准管÷细胞数量

（4）按液体体积计算

DHA(nmol/ml) =[C 标准液×△A 测定管÷△A 标准管×V 标准]÷V 样

=100×△A 测定管÷△A 标准管

C 标准液：100μmol/L；V 标准：加入反应体系中标准液体积，0.1ml；V 样总：上清液总体积，1.0 ml=0.001 L；V 样：加入反应体系中上清液体积，0.1ml；W：样品质量，g。

1. 临用前配制的试剂未使用完的 4℃保存，3 天内使用完。

2. *低检出限为 10μmol/L。