蔗糖磷酸化酶（Sucrose Phosphorylase, SP）试剂盒说明书

更新时间：2025-01-11

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分光光度法 50 管/48 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

SP(EC2.4.1.7)主要存在于微生物和植物中，裂解葡萄糖苷键，催化葡萄糖基转移到果糖、木糖、半乳糖和鼠李糖等，合成相应的葡萄糖基低聚糖。此外，SP 还能催化氢醌合成熊果苷，具有ji强的美白效果，在化妆品工业中具有重要应用。

SP 能够以磷酸为受体，催化蔗糖产生 1-磷酸葡萄糖，在葡萄糖磷酸变位酶催化下变位为 6-磷酸葡萄糖，在 6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用下还原NADP+生成NADPH，导致 340nm 光吸收值增加。测定 340nm 吸光度增加速率，即可计算SP 活性。

试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存，临用前加 6ml 蒸馏水溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存，临用前加 12ml 蒸馏水水溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

天平、低温离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、1 ml 石英比色皿和蒸馏水。

1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 提取液）进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（ml）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1ml 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g， 4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

1. 分光光度计预热 30min，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2. 操作表

试剂名称	对照管	测定管
试剂一（μl）	600	600
试剂二（μl）	100	100
试剂三（μl）	200	200
样本（μl）		100
蒸馏水（μl）	100
迅速混匀，于 1ml 石英比色皿，37℃下测定 340nm 的初始吸光值与反应 2min 后的吸光值，测定管记作A1 与A2，对照管记作A3 与A4，△A=（A2- A1）-（A4- A3）。

1. 按照蛋白浓度计算

酶活定义：37℃，pH6.8 时，每毫克蛋白质每分钟催化产生 1nmol NADPH 为一个酶活单位。

SP 活性（nmol/min/mg prot）=

2. 按照样本质量计算

e´ d

×V 反总÷V 样÷Cpr÷T=804×△A÷Cpr

酶活定义：37℃，pH6.8 时，每克样本每分钟催化产生 1nmol NADPH 为一个酶活单位。

SP 活性（nmol/min/g 鲜重）=

3. 按照细胞数量计算

e´ d

×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)÷T=804×△A÷W

酶活定义：37℃，pH6.8 时，每 10⁴ 个细胞每分钟催化产生 1nmol NADPH 为一个酶活单位。

SP 活性（nmol/min/10⁴ cell）=

个）

e´ d

×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量（万个）)÷T=804×△A÷细胞数量（万

e：NADPH 摩尔消光系数，6220 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积，1ml；V 样：反应体系中样本体积，0.1ml；W：样本质量，g；Cpr：蛋白浓度，mg/ml；V 样总：加入提取液体积， 1ml；T：反应时间，2min

1. 可选用BCA 法测定蛋白含量试剂盒测定蛋白含量。

2. 样本较多时，可以按照每个样本试剂一：试剂二：试剂三=600：100：200（μl）的比例配制工作液，用多少配多少，临用前立刻配制，10 分钟内使用。